Xenómica
A Unidade de Xenómica ten coma obxectivo dar servizo en diferentes metodoloxías experimentais para o estudo do DNA e RNA aos investigadores da Universidade de Vigo e de outros centros e institucións públicos e privados. A unidade de Xenómica ofrece aos investigadores diferentes técnicas de estudo do xenoma. Por un lado a Unidade ofrece a secuenciación de DNA e RNA, tanto polo método de Sanger coa posterior electroforese capilar no analizador xenético como a secuenciación masiva dos mesmos (NGS) empregando a tecnoloxía de semiconductores en chips de Ion Torrent. Para estas metodoloxías, nesta unidade realizase todo o proceso experimental (reacción de secuenciación e posterior purificación e análise, así como a preparación das librerías NGS e a súa secuenciación).
Por outro lado na unidade cóntase con equipamento para PCR en tempo real convencional e de PCR dixital (dPCR). Con este equipamento os investigadores poden facer cuantificacións absolutas e relativas (expresión xénica) de DNA e RNA e detectar variantes xénicas en moi baixa proporción (alelos raros). Tanto para os procesos internos coma para os usuarios externos, nesta unidade cóntase tamén con equipamento destinado ao control de cantidade e calidade do material xenético. Ademais de espectrofotómetro e fluorímetro, disponse dun bioanalizador que permite, mediante electroforese capilar en chip, o cálculo da integridade do RNA (RIN) e a cuantificación de librerías para NGS.
Na Unidade de Xenómica, ademais do traballo experimental anteriormente descrito, o persoal técnico tamén presta asesoramento aos investigadores e usuarios sobre a aplicación das devanditas técnicas instrumentais ós seus proxectos e liñas de investigación.
Equipamento instrumental
SECUENCIADOR CAPILAR SEQSTUDIO GENETIC ANALYZER
Este equipo ten 4 capilares e nel pódense levar a cabo as seguintes aplicacións: secuenciación de novo e resecuenciación (perfil de mutacións), análise de microsatélites, AFLP, LOH, detección de SNPs e “SNPs screening”.
SECUENCIADORES DE NOVA XENERACIÓN (NGS)
O secuenciador Ion torrent dispoñible é o Ion GeneStudio S5 Plus System. Con este equipo se poden levar a cabo secuenciacións con saídas de datos dende 0.3-0.5Gb ata 40-50 Gb, simplemente usando diferentes chips. Ademais, tamén dispoñemos do secuenciador de Illumina MiniSeq System que ten unha saída de datos de 1.65-7.5Gb.
ION CHEF
Este equipo é un robot para a preparación do template e para a carga dos chips para a secuenciación masiva. Ademais, permite a preparación de librerías AmpliSeq.
TERMOCICLADOR 7900 HT FAST REAL-TIME PCR
Este equipo permite a amplificación por PCR de fragmentos de DNA e a súa monitorización a tempo real co emprego de sondas fluorescentes (sondas TaqMan) ou fluorocromos intercalantes (SYBR GREEN). Ademais do bloque para pracas de 96, tamén dispoñemos dun bloque para arrays de baixa densidade (TLDA’s).
TERMOCICLADORES 7900 HT E QUANTSUDIO 6 PRO REAL-TIME PCR
Estes equipos permiten a amplificación por PCR de fragmentos de DNA e a súa monitorización a tempo real co emprego de sondas fluorescentes (sondas TaqMan) ou fluorocromos intercalantes (SYBR GREEN). Ademais, o termociclador 7900HT dispón dun bloque para arrays de baixa densidade (TLDA’s).
QUANTSTUDIO 3D DIGITAL PCR SYSTEM
A PCR realizase nun chip que contén 20000 pocillos (Digital PCR Chip v2), onde se carga a mostra e os reactivos fluorescentes (sondas TaqMan® ou SYBR GREEN™), no equipo ProFlex ™ 2x Flat PCR System. A lectura da fluorescencia do chip ten lugar no QuantStudio 3D e a análise dos datos na nube.
BIOANALIZADOR 2100 DE AGILENT TECHNOLOGIES
Este equipo permite cuantificar, integrar e comprobar a calidade de preparacións de DNA, RNA e proteínas. Ademias dos valores de cantidade tamén ofrece o valor de RIN para mostras de RNA.
NANODROP ND-1000
É un espectrofotómetro (rango de 220 a 750 nm) que permite cuantificar e calcular os valores de pureza de DNA e RNA en volumes de mostra de 1 a 2 microlitros.
FLUORÍMETRO QUBIT 4
Este equipo permite cuantificar de forma altamente específica mostras de DNA e RNA nun rango de volume entre 1 e 10 microlitros mediante a utilización de sondas fluorescentes.
Aplicacións
- Secuenciación de rexións xénicas (amplicóns, plásmidos)
- Análise de fragmentos de DNA (microsatélites, STRs, VNTRs, etc)
- Análise de mutacións puntuais e polimorfismos
- Secuenciación de novo (xenomas pequenos) e resecuenciación
- Secuenciación de exomas, transcriptomas e RNA de pequeno tamaño
- Metaxenómica
- Secuenciación de paneis de xenes diana ou a demanda (AmpliSeq DNA/RNA)
- Secuenciación con paneis deseñados de DNA circulante (cfDNA, paneis OncoMine)
- Expresión e cuantificación xénica
- Discriminación alélica mediante sondas TaqMan
- Discriminación alélica por disociación de alta resolution (HRM)
- Detección de alelos raros e cuantificación sen patróns (dPCR)
- Cuantificación espectrofotométrica e fluorométrica de ácidos nucleicos
- Control de calidade e cantidade de DNA e RNA (cálculo do RIN)
Requisitos das mostras
Os usuarios deben presentar na solicitude un documento co número e nome das mostras a analizar. Ademais dito documento indicará a natureza das mostras (DNA ou RNA) e toda a información da que se dispoña: tamaño dos amplicóns, tamaño dos insertos en plásmidos, concentración da mostra se se sabe, solvente no que están disoltas, purificadas con ExoSap ou non, etc. Cada mostra debe estar perfectamente identificada co seu nome (que preferiblemente deberá ser un número).
O volumen e concentración da mostra dependerá da aplicación a realizar. Para cuantificación necesitarase un volumen mínimo de 5 µL (incluido o Bioanalizador). Para secuenciación de Sanger necesítanse entre 100 e 300 ng, polo que o volumen da mostra estará en función da súa concentración. O recomendable serían entre 10 e 15 µL de mostra a unha concentración de 40-50 ng/µL. As mostras para migrar no secuenciador capilar deben vir xa preparadas resuspendidas en formamida con marcador de tamaños incorporado (para fragmentos) ou purificadas e resuspendidas en formamida ou auga para secuencias.
As mostras para secuenciación masiva serán primeiro avaliadas en cantidade e calidade. O volumen e a cantidade de DNA para NGS dependerá da aplicación, polo que en cada momento establecerase polo persoal desta unidade, previa consulta cos usuarios. Como norma indicativa, a cantidade mínima recomendada de DNA para NGS será de 40-60 ng/µL (cun volumen mínimo de 20 µL), inda que poden ser menores dependendo da aplicación. O DNA pode vir resuspendido en TE, Low TE, EB, etc, inda que se recomenda a súa resuspensión en auga. En canto a cantidade e calidade do RNA para NGS sucederá o mesmo, inda que non se secuenciarán mostras con valores de RIN menores de 6,5-7 salvo acordo previo cos usuarios. A preparación de librerías estándar para transcriptómica debe partirse dun mínimo de 100 ng, inda que o recomendable e ter un mínimo de 500 ng. O RNA debe vir resuspendido preferiblemente en auga.
Calquera dúbida dos usuarios sobre a calidade ou cantidade das súas mostras será consultada co persoal da unidade.