Proteómica
A Unidade de Proteómica ofrece servizo para o estudo de proteínas aos investigadores da Universidade de Vigo e de outras institucións, tanto públicas como privadas. A proteómica defínese como o estudo do proteoma (conxunto de proteínas expresado polo xenoma completo dunha célula ou un tecido nun momento determinado, baixo precisas e determinadas condicións), mediante métodos bioquímicos de separación de proteínas a gran escala, co fin de obter una visión global e integrada dos procesos celulares.
O espectro de estudo da proteómica divídese en catro grandes áreas: proteómica de expresión, proteómica de expresión diferencial, proteómica de interaccións, estructural ou de mapa celular e a modificómica, que se centra na análise das modificacións post-traduccionais. Na Unidade de Proteómica realízase tanto a identificación de proteínas como a análise de expresión diferencial, seguindo tres aproximacións metodolóxicas:
1. Cuantificación relativa do nivel de expresión de proteínas mediante análise de imaxe de xeles:
- Separación de proteínas mediante electroforese monodimensional en xeles de poliacrilamida, en condicións nativas (NATIVE-PAGE) ou desnaturalizantes (SDS-PAGE).
- Separación de proteínas mediante electroforese bidimensional (2-DE), na que a separación en xeles SDS-PAGE é precedida por un fraccionamiento baseado no punto isoeléctrico (isoelectroenfoque, IEF).
- Revelado de imaxe mediante tinción colorimétrica (Azul de Coomassie, Nitrato de Plata) ou fluorescencia (Sypro, Oriol, etc).
- Adquisición, alineamento e análise de imaxes.
2. Identificación de proteínas mediante dixestión encimática seguida da análise por espectrometría de masas e a búsqueda en base de datos:
- Análise de pegada peptídica (MALDI-MS) e de espectros de fragmentación de péptidos (MALDI-MS/MS). Utilízase para identificar proteínas purificadas, bandas de xeles SDS-PAGE e manchas proteicas de xeles 2-DE.
- Separación de péptidos por cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS/MS). Utilízase para identificar proteínas en mostras de complexidade moderada/alta, en termos de número de proteínas.
3. Identificación e cuantificación relativa do nivel de expresión de proteínas mediante análise por espectrometría de masas LC-MS/MS:
- Marcaxe isobárico (iTRAQ e TMT). Permite a comparación de ata 10 mostras nun único análise de LC-MS/MS.
- Sen marcaxe (Label-free).
Equipamento instrumental
Equipo de Cuantificación de Proteína Direct DetectTM (Merck Millipore)
Espectrómetro baseado en infravermellos (IR) que mide as ligazóns amida.
Equipos de Electroforese (Bio-Rad):
- Protean IEF System
Sistema de separación de proteínas en función do punto isoeléctrico en tiras de 7, 10 ou 17 cm de lonxitude. - Mini-PROTEAN Tetra Cell
Sistema de separación de proteínas en función da súa masa molecular relativa en minixeles de 7 cm x 8 cm x 0.75 mm. - Protean II XL
Sistema de separación de proteínas en función da súa masa molecular relativa en xeles de 19.5 cm x 18.4 cm x 1.5 mm.
Equipo de Análise de Imaxe ChemiDoc™ XRS+ (Bio-Rad)
Cámara CCD de alta resolución e sensibilidade para a adquisición de imaxes de xeles e blots de colorimetría, fluorescencia, quimioluminiscencia, etc.
Equipo de Análise de Imaxe PharosFX™ Plus (Bio-Rad)
Múltiples láseres con diversas aplicacións: bromuro de etidio, SYPRO Ruby, Deep Purple, Alexa Fluor 488, 532, 546, y 635, Cy2, Cy3, Cy5, Pro-Q Diamond, etc.
Equipo de Cromatografía Líquida FPLC ÄKTApurifier 10 (GE Healthcare)
Equipo de purificación de péptidos e proteínas con colector de fraccións Frac-950, triple detector UV (190-700 nm) e bomba P-903 (10 ml/min, 250 bar, 25 MPa).
Nano-HPLC EASY-nLC 1000 (Thermo Fisher)
Inyector automático con control de temperatura. Sistema de formación de gradientes e desgasificado de disolventes por vacío.
Espectrómetro de Masas MALDI-TOF/TOF Autoflex III Smartbeam (Bruker)
Fonte MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization) e analizador de tempo de voo (TOF, Time-Of-Flight). Láser de N2. Reflector de dúas etapas sen reixa para extracción pulsada de ions.
Espectrómetro de Masas SolariX XR (Bruker)
Imán superconductor horizontal apantallado cun campo de 7 Teslas. Fontes de ESI (Electrospray Ionization), nanoESI e MALDI. Célula de medida de resonancia ciclotrónica de ións INFINITY.
Espectrómetro de Masas LTQ-Orbitrap ELITE (Thermo Fisher)
Sistema híbrido de espectrómetro de masas de trampa iónica-Orbitrap. Acoplado a sistema EASY-nLC 1000 UHPLC. Elevada potencia de resolución e fragmentación mediante CID, HCD e ETD.
Aplicacións
Biomedicina: busca de biomarcadores, desenvolvemento de métodos de diagnóstico e pronóstico, identificación de proteínas diana para terapia, desenvolvemento de fármacos (anticanceríxenos, antimicrobianos, etc), desenvolvemento de vacinas, estudos de mecanismos de patoxénese, etc.
Bioloxía celular e bioquímica: estudo de metabolitos, toxinas, venenos, etc.
Ecoloxía e bioloxía evolutiva: adaptación ecolóxica, especiación, etc.
Tecnoloxía dos alimentos: desenvolvemento, mellora, control de calidade e seguridade alimentaria.
Requisitos das mostras
Tipos de mostra: líquido biolóxico, extracto de proteínas ou péptidos en disolución, banda ou mancha proteica, ou un xel. O servizo non acepta mostras de tecido biolóxico ou células xa que non dispón do equipamento necesario para a extracción de proteínas.Cuantificación de proteína co equipo Direct DetectTM: recomendable para mostras de entre 0.25 e 5mg/mL de proteína. Necesario un volume mínimo de 2µL. Non compatible con concentracións altas de tampón bicarbonato, EDTA, GndCl, HEPES, NaOH, Tris, Urea, glicerol, SDS, Tween, etc. Necesario facilitar ao servizo o tampón da mostra para utilizar como branco.
SDS-PAGE: a mostra debe ter unha concentración aproximada de entre 1 e 10 µg/µL.
2D-PAGE: realizar unha limpeza do extracto proteico para eliminar os sales da mostra e dos tampóns empregados na súa preparación (PBS, RIPA, HEPES, etc). A presenza de sales é crítica pola súa interferencia co isoelectroenfoque (IEF). O límite de concentración total de ións que pode ter a mostra é 40mM. O SDS é incompatible co IEF debido ao seu carácter iónico. O extracto final debe entregarse en tampón de electroforese ou liofilizado. A cantidade de proteína recomendable para un xel analítico (50-200µg) é menor que para un xel preparativo (500µg-1.5mg).
Corte e dixestión enzimática: recortar a banda ou mancha proteica cun bisturí limpo, evitando zonas de xel non tinguido e mesturas de proteínas. Realizar toda a preparación con guantes e nunha cabina de fluxo laminar para evitar a contaminación con queratinas, que se atopan no pelo, na pel e na roupa, xa que dificultan a identificación das proteínas de interese.
Análise MALDI-MS/MS: evitar a presenza de sales, deterxentes iónicos (SDS) e non iónicos (Triton X-100, Tween, etc), disolventes non volátiles (glicerol, PEG, β-mercaptoetanol, DMSO e DMF), caotrópicos (Urea, GndCl) e outros contaminantes que dificulten a cristalización da mostra coa matriz, a desorción ou a ionización. Non interfiren o TFA, ácidos fórmico e acético, HCl, DTT, NH4OH e os disolventes orgánicos volátiles.
Análise LC-MS/MS: utilizar reactivos de grao de pureza para HPLC. A cantidade de mostra dependerá do tipo de análise requerido (consultar co persoal do servizo). Se a mostra ten urea, sales ou outros posibles interferentes (SDS, PEG, glicerol, TFA, etc) é imprescindible realizar unha limpeza exhaustiva da mostra (ZipTip ou equivalente).